El error se produce porque la herramienta reconoce que ha sido alterada el ISO del original, pero se puede modificar ese archivo ISO para que parezca original y nos permita instalar Windows en la memoria USB (más información en ingles en el enlace del final)

Para solucionar este error vamos a descargar esta pequeña herramienta que nos modifica el ISO para solucionar el error: http://static.withinwindows.com/files/isoavdpcopy/isoavdpcopy_0.1.zip

La descomprimimos el Isoavdpcopy, y luego entramos a la consola CMD y vamos a la ubicación de Isoavdpcopy y alli veremos algo como esto:

Y para usarlo le pasamos como parámetro la ubicación del archivo ISO, por ejemplo así:

isoavdocopy D:Windows7x86.iso

Ahora ya se podrá utilizar ese archivo ISO con el programa Windows 7 USB/DVD Download Tool sin problemas ni el error Invalid Iso File.

Articulo en inglés: http://www.withinwindows.com/2009/11/01/use-the-windows-7-usbdvd-download-tool-with-custom-isos/